Ch.2 Quick-Start Guide: Specimen Handling and Special Tests and Procedures in Pathology 快速入門指南：檢體處理及病理學特殊檢查與程序

一、本章重點與病理術語

Highlights（本章重點）

• 眼科醫師與病理醫師經由 pathology request form（病理申請單）與 pathology report（病理報告）清楚溝通，是取得適當檢體、確保正確處理並促成準確診斷的關鍵。p.19
• 特殊情況（如懷疑惡性，或要判定 critical diagnosis（危急診斷））時，術前規劃階段直接與病理醫師討論至關重要。p.19
• 部分組織病理檢查需要 fresh tissue（新鮮組織），但通常仍需 tissue fixation（組織固定）以阻止分解、保存細胞形態。p.19
• Histochemical stains（組織化學染色）可對細胞與細胞外成分染出對比色，及／或辨識組織切片中的特定物質；immunohistochemistry（免疫組織化學）與分子遺傳技術等特殊程序改善了眼疾的診斷。p.19

Glossary（術語）

• Circulating tumor cells（CTCs，循環腫瘤細胞）：由原發腫瘤脫落的細胞，可能以抗體為基礎的檢測或分子方法在早期或晚期癌症病人血中偵測到；CTCs 的存在與不良預後相關，偵測可提供個人化風險評估的機會。p.19
• Cytology fixatives（細胞學固定液）：如 ethanol、methanol、Saccomanno fixative，用於固定抹片與液基細胞學檢體（如角膜刮片、房水與玻璃體液、fine-needle aspiration biopsy）；direct smears（直接抹片）則風乾後染色、不用固定液。p.19–20
• Direct immunofluorescence（直接免疫螢光）：與 indirect immunohistochemistry 類似，但使用單一個直接接上 fluorophore（螢光團）的抗體與選定抗原結合，以螢光顯微鏡觀察；此技術需要新鮮組織。p.20
• Flow cytometry（流式細胞儀）：分析在液流中排成單列移動之細胞的物理與化學性質；是對 hematopoietic proliferations（造血細胞增生）做 immunophenotyping（免疫分型）最常用的方法，且需要新鮮組織⁠^{Q1673 Q1674}。p.20
• Formalin fixative（福馬林固定液）：最常用的固定液 10% neutral-buffered formalin 為 40% formaldehyde solution（原文如此）；可穩定蛋白質、脂質與醣類，並使蛋白質 crosslink（交聯）以防止酵素破壞組織（autolysis，自體溶解）。p.20
• Glutaraldehyde fixative（戊二醛固定液）：用於 electron microscopy（電子顯微鏡），能快速穿透組織，保存蛋白質、glycogen（肝醣）以及 microtubules、smooth endoplasmic reticulum 等構造。p.20
• Histochemical stains：組織染料，主要為 hematoxylin and eosin（H&E）與 periodic acid–Schiff（PAS）。p.20
• In situ hybridization（ISH，原位雜交）：以標記的互補 DNA、RNA 或修飾核酸股（probe，探針）在組織切片中定位特定 DNA 或 RNA 序列；可用於石蠟包埋、福馬林固定的組織。p.20
• Indirect immunohistochemistry（間接免疫組織化學）：以可專一結合目標抗原的 primary antibody（一級抗體）偵測細胞中 1 個或多個抗原，再加上與一級抗體結合的 secondary antibody（二級抗體），產生可在光學顯微鏡下看到的有色化合物 chromogen（呈色劑）；通常使用石蠟包埋福馬林固定的切片或細胞學檢體。p.20
• Microarray（微陣列）：在單一檢測中調查數千個基因的表現，其產出稱為 gene expression profile（GEP，基因表現譜）。p.20
• Polymerase chain reaction（PCR，聚合酶連鎖反應）：將單股核酸放大數個數量級，產生特定 DNA 序列的數千到數百萬份拷貝。p.20
• Roswell Park Memorial Institute（RPMI）medium：維持生物檢體細胞活性的細胞培養液（即「fresh tissue media」）；用於檢查需要新鮮、未固定檢體時（如以 flow cytometry 排除 lymphoma）。p.20
• Tissue processing（組織處理）：自動化流程，將組織脫水，使 paraffin（石蠟）得以浸潤做成組織塊，再切片置於玻片上。p.20

二、與病理醫師溝通及送檢

Introduction（流程總覽）

• 病理實驗室處理的檢體包括 globes（眼球）、眼內內容物與眼附屬器組織；玻片通常用於組織病理診斷與其他檢查；除診斷外，組織也被評估預後與治療適用性。p.21
• 主要步驟：與病理醫師溝通 → 適當處理與運送組織（含附相關臨床資訊的申請單）→ gross dissection（巨觀解剖）準備切片 → 組織處理、製片與組織化學染色 → 考慮特殊組織技術與分子臨床診斷。p.21
• TAKE NOTE：切片或手術之前與主責病理醫師溝通，以規劃適當的檢體採集與組織固定，至關重要。p.21

Communication With the Pathologist（與病理醫師溝通）

• 手術前、中、後與病理醫師溝通是優質照護的重要一環；眼科醫師負責在送檢時提供相關臨床病史，以利 clinicopathologic correlation（臨床病理對照）並讓病理醫師做出最準確的判讀。p.21
• 資訊通常以申請單與病理報告即足以傳達；但若有特殊情況（如懷疑惡性或發現 critical diagnosis），眼科醫師與病理醫師直接、親自溝通是必要的；術前討論可讓所有相關醫師考慮最佳採檢與送檢方式。p.21
• 若曾做過切片，臨床醫師應要求複閱先前玻片，尤其有惡性病史時；病理醫師可比較前後形態與診斷，後續治療計畫可依結果調整。p.22
• TAKE NOTE：臨床診斷與組織診斷之間，或前後兩次組織診斷之間有顯著不一致時，眼科醫師應立即聯絡病理醫師解決差異。p.22
• Example 2-1：初次診斷 squamous cell carcinoma in situ（原位鱗狀細胞癌），重複切片卻為 poorly differentiated, invasive squamous cell carcinoma（低分化侵襲性鱗狀細胞癌）時，較積極的切除加上 lymph node biopsy（淋巴結切片）可能較適當。p.22

Checklist 2-1（常規檢體的病理會診清單）

• 申請單或電子醫令應提供：2 個病人識別資料；性別與年齡；病灶位置（側別與確切位置）；該部位先前切片與診斷；相關臨床病史；臨床鑑別診斷；眼科醫師電話、呼叫器及／或傳真號碼。p.21–22
• 檢體放入密封良好的容器：含足量 10% formalin（至少為切片檢體體積的 10 倍）；標籤載明 2 個病人識別資料與切片部位，貼在容器本體上、不是蓋子上。p.22
• 如相關，附上標示切片部位與切緣定位地標的示意圖（如眼瞼或結膜惡性腫瘤完整切除、ciliary body／iris tumors（睫狀體／虹膜腫瘤））。p.22

Tissue Submission（送檢）

• 檢體通常裝在含適當固定液的容器送病理實驗室；2 個病人識別資料要標在容器本體，不標在蓋子上，因為蓋子可能與檢體分開；容器標籤最好註明檢體側別與位置。p.24
• 隨檢體附上申請單或醫令，同樣要有 2 個病人識別資料，以及最新且可靠的眼科醫師聯絡方式；表單上也應提供相關臨床病史（含先前切片史）與臨床鑑別診斷。p.24
• TAKE NOTE：送病理實驗室前，檢體容器與文件都標上 2 個病人識別資料是強制要求（mandatory）。p.24

三、固定液與新鮮組織

• Formalin 是最常用的固定液，在組織中擴散快；一般而言，檢體應浸在至少為組織體積 10 倍的固定液中；固定時間依檢體大小與組成而異。p.22
• 眼球送病理時，應懸浮在 formalin 中至少 24–48 小時再處理。p.22
• 雖然眼球體積相對大，不必也不宜為確保固定而打開眼球、注射固定液或開 scleral window（鞏膜窗）；固定前打開眼球可能損傷或扭曲病灶部位，使組織判讀困難甚至無法判讀。p.22–23
• 多數病理檢查可用固定組織進行，但某些情況需要新鮮檢體：例如排除 lymphoproliferative disorders（淋巴增生疾病）的切片，或懷疑 ocular cicatricial pemphigoid（眼部瘢痕性類天疱瘡）的結膜切片，通常需要只能以新鮮組織進行的輔助診斷檢查。p.23
• 上述情況，組織可放在少量 saline（生理食鹽水）中、以生理食鹽水浸濕的紗布包裹，或浸入 tissue culture media（組織培養液）送檢；因各機構流程可能不同，術前與病理醫師諮詢以決定適當做法至關重要。p.23

Table 2-1 Fixatives Used in Ophthalmic Pathology（眼病理常用固定液）

*註：不是真正的固定液，但 prolongs tissue decomposition（原文）。出處 p.23

• TAKE NOTE：評估 ocular cicatricial pemphigoid 與其他水疱性疾病的 direct immunofluorescence 檢查通常在專門的病理實驗室進行；術前與病理實驗室溝通以確保適當送檢與處理是必要的。p.23
• 眼部細胞學檢體（角膜或結膜刮片、房水、玻璃體液、細針抽吸切片）可能需要特定固定液或特殊處理；例如結膜與角膜刮片通常以 direct smears 送檢，或可像細胞學檢體一樣以酒精固定。p.23

四、眼球摘除檢體：定側與切開

Laterality and orientation（判定左右眼與定向）

• 即使申請單已寫明側別，仍必須確認眼球的 laterality（側別），因為確實會發生不一致。p.24
• 眼球可藉辨認 long posterior ciliary arteries and nerves（長後睫狀動脈與神經）以及 superior and inferior oblique muscles（上、下斜肌）來定向。p.24
• Long posterior ciliary arteries and nerves 在視神經兩側呈筆直的藍灰色線，界定水平經線（horizontal meridian）⁠^Q345。p.24
• 眼球側別可藉分離出上斜肌與下斜肌來判定⁠^Q345。p.24
• Superior oblique muscle（上斜肌）：附著於顳上方、赤道後的鞏膜，以其最長的 tendinous insertion（肌腱附著）辨認⁠^Q345。p.24
• Inferior oblique muscle（下斜肌）：附著於顳側、黃斑所在區域的鞏膜上（inserts temporally over the macula；over 指覆蓋在黃斑外面的鞏膜表面，不是「上方」），肌腱附著最短，看起來幾乎像肌腹直接附著於鞏膜⁠^Q345。p.24
• 固定可能影響組織結構與地標，但 rectus muscles（直肌）可用來確認側別：medial、inferior、lateral、superior rectus 的附著處依序離 limbus（角膜緣）越來越遠⁠^Q345。p.24
• Fig 2-1（右眼後面觀）：照片中沒有直肌附著，因為摘除眼球時直肌通常在其鞏膜附著處切斷，以便接到 orbital implant（眼窩植入物）上⁠^Q345。p.25

Gross dissection（巨觀解剖切開）

• 確認側別後即可判定病灶方位；切開方式應讓單一張玻片盡可能呈現最多病理變化。p.24
• 眼球通常切成讓瞳孔與視神經位於同一切面，稱為 pupil–optic nerve（PO）section（瞳孔–視神經切面）。p.24
• 常規情況下，沒有手術史或眼內腫瘤的眼球通常沿 horizontal meridian（水平經線）打開，使黃斑部與瞳孔、視神經位在同一切面⁠^Q377。p.24–25
• 有手術或非手術傷口的眼球，打開時應讓傷口垂直於 PO section 並包含在其中。p.25
• 解剖前以強光 transillumination（透照）眼球：眼內腫瘤等病灶通常會擋光而投下陰影，可用 marking pencil（標記筆）在鞏膜上描出輪廓，引導切開，使切面中央包含病灶最大範圍。p.25
• Fig 2-3：切片目標是取得含最大病灶範圍的 PO section；移除兩個 caps（calottes，帽狀切塊）得到 PO section；兩刀通常由後（視神經頭）往前切，第二刀產生 PO section。p.27
• Fig 2-5：石蠟包埋的眼球可見眼內腫瘤；H&E 切片中腫瘤最大徑位於切面中央，同一切面也包含瞳孔與視神經。p.29

五、眼瞼、結膜與顳動脈切片

Eyelid and conjunctival biopsies（眼瞼與結膜切片）

• 眼瞼或結膜組織送病理時，評估 resection margins（切緣）（即病灶是否出現在切除邊緣）可能很重要。p.26
• TAKE NOTE：切緣評估高度取決於檢體大小與組織處理；檢體越小，越難準確評估手術切緣；適當的切片應包含相關病灶組織，且大小足以評估切緣，並考慮固定會造成 10% 的組織收縮。p.26
• 組織若捲起或摺疊會難以定向，且一旦以 formalin 固定就無法重新塑形；固定前應盡量攤開展平，這對結膜切片特別重要，因結膜容易捲曲。p.27
• TAKE NOTE：結膜切片應展開平放在乾的 filter paper（濾紙）或類似材料上，讓其黏附數秒，再連同濾紙輕輕浸入裝有適當固定液或培養液的容器。p.27
• 沒有天然地標的檢體，送檢前需標記以區分手術切緣；常用相距 90° 的縫線（一長一短或不同顏色）標記。p.27–28
• 在手術放大下放置的小縫線，在病理室可能難以用肉眼看到 → 縫線長度應在不借助放大下目視並剪定。p.28
• 病理實驗室在院內時，可送攤在濾紙上並附示意圖定向的新鮮組織。p.28
• 要固定的組織不建議使用 permanent marker（油性筆）與 surgical marking ink（手術標記墨水），因可能溶於固定液；應附上說明標記意義的示意圖；檢體到病理室後，邊緣會被上墨再送組織處理。p.28

Temporal artery biopsies（顳動脈切片）

• Giant cell arteritis（GCA，巨細胞動脈炎）組織學診斷的 gold standard（黃金標準）是 superficial temporal artery biopsy（淺顳動脈切片）⁠^Q309。p.29
• 取得足夠長度的檢體（約 2 cm）至關重要，因病灶可能呈斑塊狀分布（skip lesions，跳躍性病灶）。p.29
• Grossing 時動脈每 1 mm 橫切，每一段都送檢；仔細的組織檢查需 stepped sections（levels，階梯切面），通常至少評估 4 個 levels。p.29
• Verhoeff–van Gieson（elastin，彈性纖維）染色把正常顳動脈切片的 internal lamina elastica（內彈性層）染成黑色（Fig 2-6L）；Table 2-2 列其用途為 temporal artery elastic layer⁠^Q309。p.30, p.32

六、組織處理、製片與染色

Tissue processing（組織處理）

• 將檢體脫水讓石蠟浸潤，再做成 paraffin block（石蠟塊），以機械性穩定組織利於切片。p.29
• 處理中使用的有機溶劑（如 ethanol、xylene）會溶解脂質與某些合成材料，例如 acrylic 或 silicone 製的 intraocular lenses（人工水晶體），但不會溶解 silk（絲）或 nylon（尼龍）縫線。p.29
• TAKE NOTE：常規檢體處理通常需一天；快速處理技術一般保留給需緊急處理的小型切片，可能造成較差的組織製備，因此不應常規要求；外科醫師應與病理醫師直接溝通這類技術的可行性與缺點。p.29

Slide preparation and tissue staining（製片與染色）

• 石蠟組織切片通常厚 4–6 μm；切片除先天色素區外為無色。p.29
• 主要染料為 H&E 與 PAS，提供對比與顏色，讓病理醫師辨識細胞核、細胞質等細胞成分，並依化學組成凸顯各種細胞與細胞外構造。p.29, p.31
• 染色後在切片上放少量 resin（樹脂）並蓋上蓋玻片，以保護並保存組織。p.31
• Special histochemical stains（特殊組織化學染色）：用來辨識常規染色看不到的微生物與物質；通常在常規染色結果有提示或臨床懷疑特定診斷時進行。p.31
• 這些特殊染色在處理後組織切出的 permanent sections（永久切片）上進行，例外是 oil red O，需要 frozen tissue section（冷凍切片）。p.31

七、組織化學染色（Table 2-2）

出處 p.31–32

考點整理

• PAS 把 glycogen 與 proteoglycans 染成 magenta（洋紅色），用於顯示基底膜：Descemet membrane、lens capsule、Bruch membrane；Fig 2-6B 的 PAS 染色凸顯前、後水晶體囊，水晶體上皮細胞位於前囊正下方⁠^Q369。p.30–31
• 同表其他染色的顏色：GMS 把真菌成分染黑（Fig 2-6G 為黑色絲狀真菌）；Congo red 使 amyloid 呈紅橙色、偏光下蘋果綠；Verhoeff–van Gieson 把彈性纖維染黑⁠^Q369。p.30–32
• Verhoeff–van Gieson（elastin）：elastic fibers 染黑，用於顳動脈彈性層；Fig 2-6L 為正常顳動脈切片，internal lamina elastica 呈黑色。同表中 von Kossa 為 calcium phosphate salts 染黑（band keratopathy），Ziehl-Neelsen 為抗酸菌染紅（M. tuberculosis）⁠^Q309。p.30–32
• Crystal violet（結晶紫）：除 Congo red 外，辨識 conjunctival amyloidosis（結膜類澱粉沉積症）的其他有用染色包括 crystal violet 與螢光染色 thioflavin T⁠^Q309。BCSC 4 p.69
• Masson trichrome：collagen 藍、muscle 紅、granular dystrophy deposits 紅；Fig 2-6I 為 granular dystrophy 中 Masson trichrome 染紅的角膜沉積物⁠^Q342。p.30, p.32
• Granular corneal dystrophy type 2（GCD2，第 2 型顆粒狀角膜失養症）：舊稱 Avellino corneal dystrophy，兼具 GCD1 與 LCD1 的臨床、組織與超微結構特徵；Table 5-1 列其沉積物為 hyaline and amyloid，染色Congo red（+，具 dichroism）、Masson trichrome（+）、PAS（沉積物弱陽性）⁠^Q342。BCSC 4 p.111, BCSC 4 p.116
• Fite-Faraco：把部分抗酸菌染紅，用於 Mycobacterium leprae（Fig 2-6F 以紅色凸顯 M. leprae）⁠^Q342。p.30–31
• Band keratopathy 的鈣：alizarin red 把 calcium 染紅（Fig 2-6D 凸顯 Bowman layer 中的鈣沉積，上皮與基質被對比染成藍綠色）；von Kossa 把 calcium phosphate salts 染黑⁠^Q392。p.30–32
• Calcific band keratopathy 的鈣沉積在 Bowman layer 與前基質層次，H&E 切片中呈強嗜鹼性（深紫色）顆粒，可再以 alizarin red 或 von Kossa 確認⁠^Q392。BCSC 4 p.101
• Perls Prussian blue：iron 染藍，用於 Fleischer ring 與 corneal blood staining；Fig 2-6K 為 keratoconus 的 Fleischer ring 角膜上皮細胞鐵染色⁠^Q392。p.30, p.32
• Corneal blood staining 的 Fig 5-16：Masson trichrome 中紅色顆粒代表角膜基質內的 erythrocytic debris（紅血球碎片）與 hemoglobin；Perls Prussian blue 顯示基質 keratocytes（角膜細胞）內的 hemosiderin（含鐵血黃素）⁠^Q392。BCSC 4 p.106
• Fig 2-6C：Alcian blue 陽性的黏多醣物質見於 macular dystrophy；Fig 2-6E：lattice corneal dystrophy 基質沉積物 Congo red 陽性，偏光下呈 apple-green birefringence（蘋果綠雙折射）。p.30
• Fig 2-6H：Gram-positive 球菌染藍；Fig 2-6J：在腫瘤冷凍切片上做 oil red O，腫瘤細胞染藍、細胞內脂質空泡染紅。p.30

八、細針抽吸切片（FNAB）

• Fine-needle aspiration biopsy（FNAB，細針抽吸切片）：以針取得少量組織的切片技術，用於眼內腫瘤的診斷或預後判斷；在散瞳下直視進行，經玻璃體（transvitreally）或經鞏膜（transsclerally）；iris tumors（虹膜腫瘤）可能經前房取樣。p.32
• Checklist 2-2：術前與病理醫師溝通目標與流程 — 確認組織量是否足夠（尤其眼內腫瘤）；選擇適當固定液；決定是否需要新鮮組織做分子檢測或 flow cytometry；選擇應填的細胞學單或電子醫令。p.32
• FNAB 檢體使用特殊細胞學固定液，通常以酒精為基礎。p.33
• FNAB 細胞可做 cytospin preparation（將細胞離心到玻片上）；細胞量足夠時可離心並做成石蠟塊（cell block），讓病理醫師在需要且細胞量允許時進行特殊染色、IHC、ISH、microarray 與 gene expression profiling。p.33
• Fig 2-7：脈絡膜腫瘤 FNAB，細胞學可見有明顯核仁的含色素 spindle cells（梭形細胞）與大型雙核 epithelioid cells（上皮樣細胞），符合 malignant melanoma；cell block 切片以紅色 chromogen 做 HMB-45 染色呈陽性而確診，紅色呈色產物可與棕色 melanin（黑色素）區分。p.33
• 疑似 uveal melanoma（葡萄膜黑色素瘤）時，切片檢體可做基因分析，找出具預後意義的染色體異常與 gene expression profiling 型態。p.33
• 眼內 FNAB 也促進了 primary vitreoretinal lymphoma（PVRL，原發性玻璃體視網膜淋巴瘤）的診斷；疑似 PVRL 時，FNAB 檢體可依樣本量做 flow cytometric、immunocytologic、cytokine 或分子生物學分析⁠^Q1674。p.33
• 正確執行時，FNAB 不構成 tumor seeding（腫瘤播種）的主要風險；但 retinoblastoma（視網膜母細胞瘤）是明顯例外，FNAB 已被證實會增加局部與遠處腫瘤擴散風險。p.33
• 部分眼眶外科醫師用 FNAB 診斷眼眶病灶，尤其 optic nerve tumors（視神經腫瘤）與 presumed metastases（推定轉移）；但因難以在不冒併發症風險下多次穿過眶內腫瘤，FNAB 用於充分取樣眼眶腫塊的代表性區域並不理想。p.33
• TAKE NOTE：因取得的組織／細胞量常很少，眼科 FNAB 應在有這類病例經驗的 ophthalmic pathologist 或 cytopathologist 協助下進行。p.34

九、冷凍切片與流式細胞儀送檢

Frozen section（冷凍切片）

• Frozen section：組織急速冷凍後立即在 cryostat（冷凍切片機）切片；適應症為檢查結果會影響病人的術中處置。p.34
• 眼病理中永遠優先選擇 permanent sections（永久切片）（組織先處理成石蠟再切片），因形態保存較佳；此外冷凍切片可能損傷小檢體。p.34
• Checklist 2-3：需要未固定的新鮮組織；可能的話，申請前先與病理醫師溝通；申請單註明原因（精確且足夠的組織取樣、切緣評估、診斷、決定其他分子檢測，如 retinoblastoma、rhabdomyosarcoma（橫紋肌肉瘤）、metastatic neuroblastoma（轉移性神經母細胞瘤））；附切緣與方位圖；標示組織地標（如縫線）以依圖定向。p.34
• Frozen section 最常見的適應症是判定切緣是否無腫瘤，尤其是 eyelid carcinomas（眼瞼癌）；送檢做切緣評估時，檢體適當定向並配合記錄（切除部位圖、標示切緣，或以縫線等標記切緣）至關重要。p.34
• 評估眼瞼癌（如 basal cell carcinoma、squamous cell carcinoma）切緣有兩種技術：(1) routine frozen sections；(2) Mohs micrographic surgery（莫氏顯微手術），可在取得乾淨切緣的同時保留正常組織；切除眼瞼病灶時（尤其位於 canthal areas（眼角區）者）需保留組織以維持外觀與功能。p.34–35
• Fig 2-8A：眼瞼緣病灶常做 pentagonal wedge resection（五角形楔狀切除）；病理醫師取鼻側、顳側與下方切緣評估腫瘤；可做 central cross section 顯示腫瘤距下方切緣的距離；皮膚腫瘤的 elliptical excision（橢圓形切除）需以相距 90° 的縫線定向，可用 bread-loaf technique（麵包切片法）做多個橫切面。p.35
• Fig 2-8B：Mohs 手術先切除可見病灶，再由殘餘缺損的床面取薄層組織做冷凍切片，評估 en face margins（正面切緣）；另一變化是橢圓形切除後，由切下組織的底面與邊緣取 en face 冷凍切片，並在圖上標出腫瘤位置供第二階段切除。p.35
• 冷凍切片的另一適應症是確認外科醫師是否已取得足夠的診斷組織；部分中心以代表性組織做冷凍切片，評估是否適合做 flow cytometry。p.36
• 冷凍切片耗時且昂貴，應審慎使用。p.36

Flow cytometry 送檢（Checklist 2-4）

• 需要未固定、新鮮、未冷凍（unfrozen）的組織⁠^Q1673。p.36
• 切片前與病理醫師溝通檢查必要性與流程：選擇新鮮組織運送方式（不加培養液 vs 營養培養液如 RPMI）、決定所需檢體大小、考慮與實驗室的地理距離以利運送。p.36
• Example 2-2：salmon patch（鮭魚斑）樣、懷疑 lymphoma 的結膜病灶，最好新鮮送檢，以便組織可分給 flow cytometry 與常規石蠟包埋；這類檢體很小、需小心處理，溝通特別重要，有時也需慎選手術場所。p.36

十、免疫組織化學（IHC）

• 特定細胞型態可表現特定抗原，病理醫師據此辨認細胞型態或細胞來源（通常用於腫瘤）；Immunohistochemistry（IHC，免疫組織化學）是偵測特定抗原的常用方法。p.36
• 多數情況下流程為：primary antibody 結合細胞內或細胞表面的特定抗原 → 接有 chromogen（經化學反應產生特定顏色的化合物）的 secondary antibody 結合一級抗體。p.36
• 最常見的 chromogen 呈色產物為棕色或紅色；紅色 chromogen 在處理含色素的眼組織與 melanoma 時特別有利，因可與葡萄膜組織或腫瘤中的棕色 melanin 形成對比。p.37
• Fig 2-9：orbit 的 metastatic carcinoid（轉移性類癌）H&E 下呈溫和上皮特徵，以抗 chromogranin 抗體凸顯其 neuroendocrine（神經內分泌）性質。p.37
• 許多抗體常規用於診斷、治療與預後；但抗體的 specificity（特異性）與 sensitivity（敏感性）各異，會影響判讀 → 與適當的標準化對照比較至關重要；自動化設備與 antigen retrieval（抗原修復）技術可調整以提高敏感性、縮短報告時間。p.37–38

Table 2-3 Common Immunohistochemical Stains（常用 IHC 染色）

出處 p.38

Key Antibodies at a Glance（重點抗體）

• Cytokeratins（多種亞型）：診斷上皮腫瘤（如 adenoma、carcinoma）。p.39
• Desmin、myoglobin 或 actin：診斷平滑肌或骨骼肌來源（如 rhabdomyosarcoma、leiomyoma）。p.39
• S-100 protein：診斷 neuroectodermal（神經外胚層）與 neural crest（神經嵴）來源腫瘤（如 schwannoma、neurofibroma、melanoma）；Table 2-3 中 schwannoma 列 S-100 與 GFAP⁠^Q353。p.38–39
• Melan A 與 HMB-45：診斷 melanocytic tumors（如 nevus、melanoma）⁠^Q353。p.39
• Chromogranin 與 synaptophysin：診斷 neuroendocrine tumors（如 metastatic carcinoid、small cell carcinoma）。p.39
• Leukocyte common antigen（白血球共同抗原）：診斷造血來源腫瘤（如 leukemia、lymphoma）。p.39
• CD（cluster of differentiation/designation）：白血球（特別是淋巴球）亞型分類的抗原。p.39
• BAP1：腫瘤的診斷與預後（如 uveal melanoma 的預後）。p.39

十一、分子病理

• 分子生物技術越來越常用於診斷性眼病理，並廣泛用於實驗病理；這些技術需要特殊組織處理；近來應用擴展到疾病預後判斷與治療選擇。p.39
• Comparative genomic hybridization（CGH，比較基因組雜交）、PCR 或 array CGH 已被用來找出 tumor-promoting（促腫瘤）或 tumor-inhibiting（抑腫瘤）基因（如 retinoblastoma gene）⁠^Q1673。p.39
• PCR 或 in situ hybridization（ISH）已被用來辨識病毒 DNA 或 RNA 股，如 herpesviruses 與 Epstein-Barr virus。p.39
• 分子技術不僅能辨識核酸股的有無，也能在特定細胞內定位精確的 DNA 序列（如 fluorescence in situ hybridization（FISH）或 ISH）。p.39
• 兩大技術 PCR（及其變化）與 microarray（及其亞型）大幅推進了對發育生物學與腫瘤生成的認識。p.39

Polymerase chain reaction（PCR）

• 將單股核酸放大數個數量級，產生特定 DNA 序列的數千到數百萬份拷貝；依賴反覆加熱與冷卻的 thermal cycles（熱循環）進行熱變性與酵素複製。p.39–40
• 所需成分：primers（引子）（含與標的區互補序列的短 DNA 片段）、DNA polymerase、nucleotides；PCR 的選擇性取決於引子的特異性；從各種組織與體液成功萃取 DNA 取決於檢體狀況。p.40
• 變化型包括 reverse transcription PCR、touchdown PCR、real-time PCR、nested PCR、strand displacement amplification、rolling circle amplification、ligase chain reaction、helicase-dependent DNA amplification、multiplex PCR 等。p.40
• 偵測到 PCR 產物的臨床意義取決於許多變數（所選引子、實驗室對照、人口學考量）→ 對做臨床病理診斷的臨床醫師而言，PCR 最好作為常規病理診斷技術的輔助。p.40
• 臨床用途：傳統上常規使用限於 leukemias、lymphomas、soft-tissue neoplasms（軟組織腫瘤），以及組織病理無法確診的腫瘤；現在越來越多用於偵測感染原（如 herpesvirus family）、腫瘤預後判斷（如 uveal melanoma），以及偵測可用標靶治療的基因變化（如 cutaneous melanoma 與 hematologic malignancies）。p.40
• Example 2-3：real-time PCR／DNA probe hybridization 可用來排除感染原；diagnostic vitrectomy 取得未稀釋玻璃體樣本（0.5–1 cc）送分子診斷，例如排除 herpes simplex virus types I and II、varicella-zoster virus、cytomegalovirus、toxoplasmosis 與 Mycobacterium tuberculosis complex。p.40
• Example 2-4：chronic vitritis（慢性玻璃體炎）病人的 diagnostic vitrectomy 可送分子診斷以排除 primary vitreoretinal lymphoma；未稀釋或稀釋的玻璃體樣本（0.5–1 cc）可用 PCR 檢測 B-cell lymphoma 的 immunoglobulin heavy-chain rearrangement（免疫球蛋白重鏈重組），並以 DNA allele-specific PCR 檢測 MYD-88 L265P somatic gene mutation⁠^Q1674。p.40
• PVRL 的診斷（BCSC 4 第 9 章）：免疫組織化學上存活腫瘤細胞通常呈 B-cell markers；flow cytometry 可能有助於證明 monoclonal population（單株族群）；其他可能有用的檢查包括 lymphocyte gene rearrangement 與 MYD88 pathogenic variants 的分子檢測，MYD88 pathogenic variants 見於約 80% 的 PVRL；IL-10 對 IL-6 比值 > 1.0 在特定病例可能是有用的指標⁠^Q1674。BCSC 4 p.164

Microarray（微陣列）

• 在單一檢測中調查數千個基因的表現，產出 gene expression profile；用於了解人類生長發育、正常與異常生物過程的分子機轉，並闡明許多疾病的遺傳成因。p.40–41
• DNA microarrays 最初是為量化少數具臨床意義基因的表現而開發，之後應用於腫瘤診斷與惡性腫瘤的抗藥性。p.41
• 種類：DNA microarrays（最常見）、microRNA microarrays（如 MMChips）、protein microarrays、tissue microarrays。p.41
• 所有 DNA microarray 平台的基本過程：代表特定基因編碼區的寡核苷酸或 DNA 片段（稱 probes）與螢光或化學冷光標記的純化 cDNA 或 cRNA（稱 target）雜交；原始資料以雷射掃描取得，輸入資料庫並以統計方法分析。p.41
• 驗證 microarray 結果是基因表現分析的關鍵步驟；quantitative（real-time）PCR 是驗證 gene expression profiling 的首選方法。p.41
• 臨床用途：部分商用 microarray 與 PCR 平台可依腫瘤的轉移潛力將切片大小的腫瘤樣本分層；但這些檢測的費用常明顯高於傳統診斷方式，開立前應與病人討論。p.41
• Example 2-5：以 FNAB 取得的 uveal melanoma 檢體做 gene expression profiling，可將 5 年轉移風險分為 3 個預後組：1A、1B、2。p.41

Circulating tumor cells（CTCs，循環腫瘤細胞）

• 腫瘤細胞可自原發腫瘤脫離並進入血流；CTC 偵測通常依賴分子標記，標記可能因癌症種類而異；epithelial cell adhesion molecule（上皮細胞黏附分子）是 CTC 偵測最廣泛使用的分子標記之一。p.41
• 只有一小部分 CTCs 能存活並啟動轉移，提示 CTCs 與不利的血液微環境之間的交互作用與調節是 CTC 轉移的關鍵。p.41
• 大規模 single-cell sequencing（單細胞定序）已用於揭示 CTCs 的基因體與轉錄體，可用於監測癌症治療反應與評估預後。p.41

十二、診斷性電子顯微鏡

• Diagnostic electron microscopy（DEM，診斷性電子顯微鏡）：歷史上用於辨認分化不明腫瘤的細胞來源，而不是用來區分良性與惡性過程。p.42
• 目前在特定病例中，DEM 用於 IHC 不足以準確診斷時輔助免疫病理研究；但 DEM 比 IHC 較不普及且較昂貴。外科醫師應在術前與病理醫師討論是否需要、是否可行，並確保組織適當固定。p.42
• Checklist 2-5（分子技術與電子顯微鏡）：切片前與病理醫師討論 — 鑑別診斷；固定液或運送培養液（新鮮 vs 酒精 vs glutaraldehyde vs 其他）；切片流程（特定日期時間是否有專門人員、依與實驗室的地理距離最佳化運送）。p.42
• Example 2-6：為排除 progressive external ophthalmoplegia（進行性外眼肌麻痺）的 extraocular muscle biopsy（眼外肌切片）可新鮮送檢，分流做常規組織染色、冷凍組織上的特殊組織化學染色（Gomori trichrome、oil red O、PAS、快慢肌纖維的 myosin heavy-chain 抗體染色、Cox-10/SDH、SBSD 粒線體染色），以及 DEM 以研究細胞內 mitochondria（粒線體）的數目、大小與位置。p.42
• 電子顯微鏡檢體的固定液為 2.5% glutaraldehyde（如角膜 microsporidia）。p.23