Ch.5 Molecular Genetics 分子遺傳學

一、細胞分裂與細胞週期（Cell Division and the Cell Cycle）

本章重點（Highlights）

• 細胞分裂經由 cell cycle（細胞週期）進行；tumor suppressor genes（腫瘤抑制基因）的功能是調控此週期，其改變可造成多種具眼部表現的疾病，例如某些 neurocutaneous disorders（phakomatoses，母斑症）與 retinoblastoma（視網膜母細胞瘤）。p.179
• 約 99% 的 DNA 不編碼蛋白質，可能參與基因表現的調控；epigenetics（表觀遺傳學）指研究不改變 DNA 序列、卻可遺傳地改變基因表現之過程的學問。p.179
• Transcription factors（轉錄因子）決定由 DNA 產生 mRNA 的速率；PAX genes 家族編碼轉錄因子，其 pathogenic variants（致病變異，mutations）與多種眼科疾病的發生有關。p.179
• 新的基因治療，如 AAV（adeno-associated virus，腺相關病毒）vector gene therapy 與 CRISPR–Cas9 system，對許多過去無法治療的眼病具有很大潛力。p.179

Cell division 與 cell cycle 的分期

• 細胞分裂有 2 型：mitosis（有絲分裂）＝somatic cell（體細胞）分裂；meiosis（減數分裂）＝germinal cell（生殖細胞）複製。p.179
• Cell cycle 有 4 期：G1（生長、為 DNA 合成做準備）→ S（DNA 合成／染色體複製）→ G2（生長、為 mitosis 做準備）→ M（mitosis 與 cytokinesis）⁠^Q191。p.179
• M phase 包含 2 個過程：mitosis（複製後的染色體分成 2 組相同的群）與 cytokinesis（胞質分裂）（細胞質一分為二），形成 2 個遺傳上相同、與親代細胞同為 diploid（雙套）染色體數的子細胞。p.179–180
• M phase 依序細分為：prophase（前期，染色質濃縮成染色體）→ metaphase（中期，染色體排列在細胞中央）→ anaphase（後期，染色體分開移向兩極）→ telophase（末期，兩極形成 2 個子細胞核）。p.180
• 暫時停止分裂的細胞進入靜止狀態，稱 G0 phase（quiescence）。Fig 5-1：細胞接收分化訊號後離開週期進入 terminal differentiation（終末分化）；某些情況下細胞可回到 G0 或進入 apoptosis（細胞凋亡）路徑。p.180

Cell cycle regulation（checkpoints）

• 細胞週期由一期轉到下一期受 checkpoints（檢查點）調控；重要檢查點：G1 checkpoint＝G1 → S 的轉換、G2 checkpoint＝G2 → M 的轉換。檢查點確認前一期已成功且無誤地完成⁠^Q191。p.180–181
• G1 checkpoint：評估 細胞大小、營養與 growth factor（生長因子）是否足夠，並檢查 DNA 是否損傷；完成 G1 checkpoint 後，細胞即承諾進行細胞分裂，否則進入靜止的 G0 phase⁠^Q191。p.181
• G2 checkpoint：在週期進入 M phase 之前進一步檢查 DNA。任一檢查點發現 DNA 損傷時，可能進行修復，或啟動 programmed cell death（計畫性細胞死亡）⁠^Q191。p.181
• 檢查點調控經由 cyclins 與 cyclin-dependent kinases（CDKs）；在 G1 checkpoint，CDK 磷酸化 retinoblastoma（Rb）家族蛋白，促進下游轉錄以準備 S phase。像 Rb 家族這類 tumor suppressor genes 常參與細胞週期調控，而細胞週期調控失調可導致癌症⁠^Q191。p.181
• Clinical pearl：Checkpoint inhibitors（檢查點抑制劑）屬 immunotherapy（免疫治療），用於多種癌症，一般藉增強免疫系統攻擊腫瘤細胞的能力；免疫活性增強可造成從 dry eyes（乾眼）到 multifocal choroiditis（多灶性脈絡膜炎）的眼部副作用。p.181

Meiosis（減數分裂）

• Meiosis 包含 2 次連續分裂（meiosis I 與 meiosis II），產生 eukaryotes（真核生物）有性生殖所需的 ova（卵）與 sperm（精子）；與 mitosis 不同，meiosis 中染色體會進行 recombination（重組），使每個配子的基因組合不同。p.181
• Meiosis 產生 4 個遺傳上獨特的 haploid（單套）細胞；mitosis 產生 2 個遺傳上相同的 diploid 細胞。p.181
• Meiosis 的 interphase 由 G1 與 S phase 組成（meiosis 沒有 G2 phase），之後是 meiosis I 與 meiosis II，兩者都分 prophase、metaphase、anaphase、telophase。p.181
• G1 期人類細胞含 46 條染色體（與體細胞相同）；S 期每條染色體複製成 2 條相同的 sister chromatids（姊妹染色分體）。p.181
• Meiosis I：homologous chromosomes（同源染色體，各來自父母一方）分離到 2 個細胞，使原細胞的 ploidy（倍性）減半；Meiosis II：sister chromatids 分開，2 個細胞再分裂成 4 個 haploid 子細胞。p.181
• 配子：男性為 sperm、女性為 ovum；受孕時兩者結合成含 46 條染色體的 zygote（合子）。Fig 5-2 顯示 meiosis I 或 II 期間可發生 chromosomal nondisjunction（染色體不分離，詳見 Chapter 6）。p.182
• Chromosomal crossing over（染色體互換）：同源染色體間交換遺傳物質，形成重組染色體；發生於 meiosis I 的 prophase（prophase I）。相同基因以相同順序排列，但 alleles（等位基因）不同，因此理論上子代可具有親代 alleles 的任何組合（independent assortment 理論）。p.182–183

二、基因與染色體（Genes and Chromosomes）

• Gene（基因）是遺傳的基本單位，各帶一段核苷酸序列，編碼單一性狀或單一 polypeptide chain（多肽鏈）及其調控區。人類基因大小約 500 bp 到超過 200 萬 bp；但 >98% 的人類基因介於 <10 kb 到 500 kb（1 kb＝1000 bp）。p.183
• 單一人類細胞的 DNA 足以容納 600 萬個基因，但 23 對染色體約含 20,000–25,000 個基因；其餘 99% 的遺傳物質可能參與基因表現的調控。p.183
• Genetic map（遺傳圖譜）：基因沿染色體線性排列的相對順序；locus（基因座）：單一基因在染色體上占據的物理位置或區域。基因座彼此相鄰造成基因間的緊密關聯（linkage）與成群一起或分開移動（segregation）。p.183
• 正常人類體細胞有 46 條染色體（23 對），每對一條來自父親、一條來自母親；正常精子或卵子含 23 條。46 條中 44 條為 autosomes（體染色體），其餘 2 條為 X 與 Y 染色體。p.183
• 現已知某些疾病（如 retinitis pigmentosa，RP，色素性視網膜炎）涉及眾多基因；基因與染色體位置資訊可在電子資料庫如 OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）查詢。p.183

Alleles（等位基因）

• Alleles：同一對同源染色體上同一基因座的不同形式。就某一體染色體基因座而言，兩個 allele 相同＝homozygous（同型合子）；不同＝heterozygous（異型合子）。p.183–184
• 不同的基因缺陷可產生差異極大的表型但仍為 allelic：例如 sickle cell disease（SS hemoglobinopathy，1 種致病變異的同型合子）與 SC hemoglobinopathy 表型明顯不同，但 Hb S 與 Hb C 基因互為 alleles。p.184
• Polyallelism（多等位性）：單一基因可能有許多變異。例：α-L-iduronidase 在 severe MPS I（Hurler syndrome）與 attenuated MPS I（Scheie syndrome）都有缺陷——同一酵素、同一基因的變異，但臨床嚴重度（發病年齡、發現年齡、骨骼／肝／脾／角膜受侵犯程度）完全不同。p.184
• 一個 codon 的鹼基置換若改變遠離活性位置的胺基酸，對酵素功能影響有限；但在活性位置關鍵處置換 1 個胺基酸，可能使大部分或全部酵素活性喪失。p.184
• Compound heterozygote（複合異型合子）：同一基因座有 2 個不同的 allelic variants（一般 heterozygote 則是 1 個變異＋1 個「正常」allele）；attenuated MPS 的 compound heterozygote 臨床表現介於兩種 allele 各自同型合子之間。p.184

Segregation、Independent assortment、Linkage

• Segregation（分離）：同一基因座上的 2 個 allele 在 meiosis 時分開、進入不同配子，因此不能同時出現在帶原者的單一子代；例如同時帶 Hb S 與 Hb C 的 compound heterozygote 父母，子代只會從該親得到其中一種。p.184
• Independent assortment（獨立分配）：不同（非同源）染色體上的基因在 meiosis 中隨機分配，nonallelic genes 彼此獨立分配；同一染色體上的 2 個 nonallelic dominant（syntenic）性狀，子代可能兩者皆得、皆不得，或因 crossing over 只得其一。p.184–185
• 平均每次 meiotic division 約發生 50 次 crossovers（每條染色體 1–3 次）。p.185
• Linkage（連鎖）是 independent assortment 定律的主要例外：同一染色體上相當接近的基因，比隨機預期更常一起傳遞；兩基因座越近，越不易受 crossover 影響。p.185
• 遺傳距離以 centimorgan（cM）表示（紀念描述 crossing over 的 Thomas Hunt Morgan）：1 cM（約 100 萬 bp）＝兩基因有 1% 機率發生互換。線性物理距離接近不能自動保證連鎖，因為每條染色體上某些位點可能較易發生同源互換。p.185
• Linkage disequilibrium（連鎖不平衡）：族群中 allele 組合出現的頻率高於或低於依其距離所預期的頻率。p.185

三、基因結構、粒線體 DNA 與非編碼 DNA（Gene Structure, Noncoding DNA）

Gene structure

• 基因由 DNA 構成，主要位於細胞核並組成大小不同的染色體；人類有 22 對編號染色體（由最大 1 號到最小 22 號）及 1 對性染色體（XY 或 XX）。p.185
• DNA 的 4 種鹼基：adenine（A）、cytosine（C）、guanine（G）、thymine（T），組成 double helix（雙螺旋），可進行複製、轉錄與轉譯。比喻：基因＝百科全書的章、exons＝句子、trinucleotides＝字、nucleotides＝字母。p.185
• 染色體 DNA 的複製與 RNA 合成（transcription，轉錄）在細胞核內進行；mRNA 被運送到細胞質的 ribosomes（核糖體）轉譯成胺基酸序列。p.186
• mRNA 的 initiation codon（起始密碼）之後是 structural open reading frame，由 exons（外顯子）＝編碼最終蛋白質中胺基酸的序列與 introns（內含子）＝mRNA 處理過程中被剪除的序列組成；最後一個 exon 之後為 3' untranslated region，部分具調控功能⁠^Q164。p.186
• Fig 5-3：雙螺旋分為 noncoding regions（含 introns 與 promoter regions）與構成基因的 coding exons；intron 在轉錄後、mRNA 完成前被剪除⁠^Q164。p.186
• 高等生物中 introns 的發展可能帶來演化上的好處：exons 的區隔化可能經由 alternative splicing（選擇性剪接）與基因複製時的 exon shuffling 促進蛋白質快速演化。有些 introns 含完整獨立的基因，有些可能致病或影響其他基因表現；introns 內不穩定重複序列的擴增可造成異常剪接而致病。小的插入與缺失很常見，稱 indels。p.187

Mitochondria 與 mtDNA

• Mitochondria（粒線體）是 oxidative phosphorylation（氧化磷酸化）的場所、細胞的發電廠；是 2 種原始單細胞生物共生融合成真核生物的遺跡，仍保有自己的 DNA。p.185–186
• 每個粒線體含 2–10 份短的環狀 DNA，含 13 個參與氧化磷酸化的蛋白質編碼基因。p.186
• Heteroplasmy（異質性）：因每個粒線體有多份 DNA、每個細胞有多個粒線體，同一細胞內及同一人不同細胞間的 mtDNA 可能不同。p.186
• 人類的粒線體來自 ovum（卵子），因此 mtDNA 遵循 maternal line inheritance（母系遺傳）；mtDNA 疾病以第四種方式遺傳，稱 maternal inheritance（有別於 autosomal dominant、autosomal recessive、X-linked 三種 monogenic 模式）⁠^{Q97 Q141 Q196}。p.186, p.194
• Mitochondrial disease：遺傳模式提示 maternal transmission 時應考慮；雖表面上可能類似 X-linked，但受影響女性的所有子女（女兒與兒子）都可能遺傳到，但只有女兒能再傳下去⁠^{Q97 Q141 Q163}。BCSC 2 p.240
• 粒線體疾病成因分類（Table 6-9）：mtDNA 大片段重排（缺失或插入），如 CPEO、Kearns-Sayre syndrome、Pearson syndrome；mtDNA 編碼的 ribosomal RNA 變異，如母系遺傳感音性耳聾與 aminoglycoside 誘發耳聾；mtDNA 編碼的 transfer RNA（tRNA）變異，如 MELAS、MERRF、MIDD 及約 30% 的 CPEO；missense 與 nonsense 變異，如 LHON 與 NARP⁠^{Q112 Q114 Q163}。BCSC 2 p.241
• 約 50% 的 CPEO 病人可檢出 mtDNA deletions，Kearns-Sayre syndrome 幾乎全部有大片段缺失；MELAS 與 mtDNA 第 3243 位 A→G 點變異有關，影響 mtDNA 編碼的 tRNA⁠^{Q97 Q163 Q196}。BCSC 2 p.241
• LHON（Leber hereditary optic neuropathy）：男性盛行率高於女性，但不符合典型 X-linked 傳遞；受影響男性的子代不會遺傳，女性病人的女兒與兒子幾乎都會遺傳到。約 50% 與 ND-4 基因第 11778 位 G→A 有關⁠^{Q104 Q163 Q196}。BCSC 2 p.242–243
• NARP 與 ATPase-6 基因第 8993 位單一鹼基對變異有關⁠^Q112。BCSC 2 p.243

Noncoding DNA（非編碼 DNA）

• 大部分 DNA——人類 DNA 鹼基序列中約 99%——不編碼蛋白質。p.187
• Noncoding DNA 包含 introns、promoters，以及染色體與粒線體內的其他區域，參與調控基因表現與 exon 剪接⁠^Q164。p.187
• Noncoding DNA 含高度重複序列，包括 satellites、microsatellites、short interspersed elements、long interspersed elements；300 bp 的 Alu sequence 是出現最頻繁的重複 DNA 序列（以辨識它的限制酶命名）。p.187
• 部分重複性 noncoding DNA 形成 telomeres（端粒），對染色體正確形成與維持不可或缺；telomeric DNA 流失與 cell senescence（細胞老化）相關，telomeric DNA 維持缺陷被認為可能與 carcinogenesis（致癌）有關⁠^Q164。p.187
• 由 noncoding DNA 轉錄的 RNA 可能直接影響其他序列的轉錄，並參與正常基因體修復與調控。p.187

四、轉錄、轉譯與表觀遺傳（Central Dogma, Splicing, Epigenetics）

Central dogma 與 transcription factors

• Central dogma（中心法則）：DNA 序列轉錄成 mRNA，再轉譯為蛋白質的胺基酸序列。因三聯密碼有冗餘性，核苷酸改變不一定改變胺基酸。p.187
• DNA 的編碼區由 exons 組成，數個 exons 剪接在一起構成完整的 RNA 編碼序列。p.187
• 基因表現也受遺傳與環境決定的回饋與調控機制調節：methylation（甲基化）與 histone formation 可使基因表現沉默；siRNA（small／short interfering RNA）可阻斷 mRNA 轉譯⁠^Q176。p.187
• Epigenetics：研究上述調控機制對基因與疾病表現的影響；基因表現的調控同時發生在 transcription 與 translation 層次。Translation 在 ribosomes 進行，mRNA 誘導 tRNA 招募胺基酸以「組裝」蛋白質。p.188
• Transcription factors：結合特定 DNA 序列、控制 DNA → mRNA 遺傳資訊流動的蛋白質，藉促進或抑制 RNA polymerase 被招募到特定基因而作用。人類基因體中約 10% 的基因編碼轉錄因子；轉錄因子含 1 個以上 DNA-binding domains，附著在其調控基因附近的特定 DNA 序列。p.188
• 轉錄因子基因家族包括 homeobox 與 paired box genes；PAX6 是眼睛發育的 master control gene（主控基因），例示轉錄因子在胚胎發生中的關鍵角色⁠^Q140。p.188–189
• Homeobox genes（HOX）含一段高度保守、約 180 bp 的 DNA，編碼保守的 60 個胺基酸序列構成 homeodomain，使蛋白質具特定 DNA 結合能力；HOX genes 藉 homeodomain 結合 DNA promoter 調控下游基因的表現，作為 master regulators⁠^Q140。BCSC 2 p.172

• Clinical pearl：許多眼科疾病源於轉錄因子致病變異——PAX2 變異可能造成 colobomas of the optic nerve（視神經缺損）與 renal hypoplasia（腎發育不全）；PAX3 變異可能造成伴 dystopia canthorum（內眥異位）的 Waardenburg syndrome（WS1 與 WS3）；PAX6 變異是幾乎所有 aniridia（無虹膜症）病例、偶發 Peters anomaly 病例，以及數種較罕見表型（autosomal dominant keratitis 與 dominant foveal hypoplasia）的基礎⁠^{Q137 Q140 Q151}。p.189
• Granular corneal dystrophy（顆粒狀角膜失養症，GCD1、GCD2）列於 epithelial–stromal TGFBI dystrophies：此類失養症由同一基因 TGFBI 的致病變異造成，定位於 5q31⁠^{Q137 Q151}。BCSC 8 p.188–189

Translation（轉譯）

• Ribosome 轉譯 mRNA 的 3 個階段：initiation（起始）、elongation（延長）、termination（終止）。起始：mRNA 與小核糖體次單元結合，攜帶 methionine 的 tRNA 結合 start codon，大次單元結合後形成起始複合體；終止：stop codon 進入 ribosome。p.189
• 轉譯在多層次受調控，包括 initiation、核糖體磷酸化與 siRNA 干擾；終止後可能有 post-translational modifications（轉譯後修飾）：acetylation、methylation、phosphorylation、glycosylation。p.189
• Clinical pearl：用於處理 glaucoma、diabetic retinopathy、age-related macular degeneration（AMD）與 RP 等數種眼病的 siRNA 療法正在評估中。p.189

Intron excision 與 alternative splicing

• Splicing（剪接）：exons 在 ribosome 轉譯前，introns 經高度組織化的過程從 mRNA 切除，只留下 exons；在由 RNA 與蛋白質構成的 spliceosomes 進行。剪接錯誤可致遺傳疾病。p.189
• 約 15% 致病的 single-nucleotide（point）variations 是經由造成剪接錯誤致病，如 exon skipping、intron retention 或使用 cryptic splice site；例如參與剪接之蛋白質的致病變異可造成 RP。p.189
• Alternative splicing：同一基因經不同 promoters 作用產生多種 pre-mRNA 序列（promoters 使某些 exons 在轉錄時被跳過）；產物常稱 isoforms。因 promoters 通常具組織特異性，不同組織可表現不同 isoforms。p.190
• 例：dystrophin——全長 dystrophin 是肌肉主要表現的 isoform；較短的 isoforms 在 retina、周邊神經與中樞神經系統占多數。p.190
• Alternative splicing 也是 corneal avascularity（角膜無血管性）的基礎：角膜大量表現選擇性剪接的 soluble VEGF receptor 1（sVEGFR-1），存在於細胞外基質，作為內生性 VEGF trap（decoy receptor，誘餌受體）；沒有 sVEGFR-1，游離 VEGF 會增加，角膜易被血管侵入。p.190

Methylation、Imprinting、X-inactivation

• Methylation：正在轉錄的 DNA 區域缺乏 5-methyl cytosine（通常占總 DNA 的 1%–5%）。甲基化與 gene inactivation（基因不活化）密切相關，DNA 甲基化的調控可能負責控制 imprinting；因此甲基化可能解釋某些疾病表型表現的差異⁠^Q176。p.190
• Genomic imprinting（基因體印記）：一種可遺傳但可逆的過程，基因依提供它的親代不同而被修飾；機制不明，但似乎在 chromatin-organization 層次運作，涉及 heterochromatization 與 CpG 位點甲基化。可被印記的基因例：Wilms tumor suppressor gene、SNRPN gene⁠^Q176。p.190

SNRPN 基因定位於 15q11–q13，似乎只由父源 allele 表現。p.190

• X-inactivation（lyonization）：人類胚胎早期，女性 2 條 X 染色體之一隨機、永久地失活，使該染色體大部分基因不表現；確切時間不明，被認為發生在 blastocyst–gastrula 轉換期的數次細胞分裂內；以發現者 Mary Lyon 命名。p.191
• Lyonization 影響數種 X-linked 視網膜疾病表型的嚴重度，如 RP 與 incontinentia pigmenti（色素失調症）。p.191

五、DNA 損傷與修復、細胞凋亡（DNA Damage and Repair, Apoptosis）

• DNA 不斷受 mutagens（致突變原）損傷，如 ultraviolet（UV）light、化學物質與自發性 deamination（脫胺）；每個細胞每天僅因正常體溫下 DNA 自發分解就流失 10,000 個鹼基。未修復的改變累積可形成腫瘤；估計受損 DNA 造成人類約 80%–90% 的癌症。p.191
• DNA 修復的 2 大機制：excision repair（切除修復）與 mismatch repair（錯配修復）。Meiosis 互換時切割或修補 DNA 的酵素也參與 DNA 修復；解開雙股 DNA 的 helicases 參與複製、轉錄與 DNA excision repair。p.191
• p53（TP53，tumor protein P53）似乎扮演「guardian of the genome（基因體守護者）」，防止 DNA 不可修復損傷的細胞增生；UV 或游離輻射暴露後 p53 濃度上升；p53 藉與 RNA polymerase transcription factor IIH 交互作用抑制 DNA 複製。p.191
• 損傷輕微 → p53 增加誘導可逆的細胞停滯直到修復；損傷過大或不可逆 → p53 大量增加，觸發 apoptosis（很可能經刺激 BAX 基因表現）。失去 p53 時細胞不會停滯修復也不會凋亡，因此 p53 致病變異使人易發生腫瘤。p.191
• Ataxia-telangiectasia（Louis-Bar syndrome）：受影響基因為 protein kinase ATM，似乎參與 DNA 修復（可能告知細胞輻射損傷）；ATM 產物與 synaptonemal complexes 結合、促進染色體聯會，為 meiosis 所需。病人罹癌風險高 3 倍。p.191
• Xeroderma pigmentosum（著色性乾皮症）：修復 UV 損傷 DNA 的酵素功能受損；病人典型在日曬部位皮膚有瀰漫性色素異常，basal cell carcinoma、squamous cell carcinoma 與 melanoma 風險高；也可發生 ocular surface cancers（squamous cell carcinoma 與 melanoma）。p.191–192

Apoptosis（細胞凋亡）

• Apoptosis 一詞源自希臘文「樹葉飄落」（ptosis 同字根）；是多細胞生物的 programmed cell death（計畫性細胞死亡），而 necrosis（壞死）是急性細胞損傷造成的創傷性細胞死亡。p.192
• 形態變化：cell shrinkage（細胞皺縮）、nuclear fragmentation（核碎裂）、chromatin condensation（染色質濃縮）、chromosomal DNA fragmentation。Mitochondria 是數個關鍵事件的標的：釋出 caspase activators、電子傳遞改變、粒線體跨膜電位喪失、redox 反應改變、活化 pro- 與 antiapoptotic Bcl-2 家族蛋白。p.192
• 胚胎期：scaffolding cells（如眼瞼張開過程相關的細胞）經 epidermal apoptosis 移除。日後：apoptosis 過多造成 atrophy（萎縮），如 RP 或 glaucoma；apoptosis 不足造成細胞不受控增生，如 cancers（包括 retinoblastoma）。p.192

六、致病變異與多型性（Pathogenic Variants and Polymorphisms）

• Pathogenic variant（致病變異，mutation）：基因結構或序列的改變；可隨機發生在基因 DNA 序列的任何位置，可源於 1 個核苷酸被另一個取代（single-nucleotide variation）。改變胺基酸的 single-nucleotide variation 稱 missense variant。p.192
• 變異不一定改變胺基酸序列（不同 codon 可編碼同一胺基酸）；noncoding 部分的變異可能有、也可能沒有臨床後果；變異也可能改變蛋白結構但不明顯影響功能。編碼同一胺基酸或產生可耐受胺基酸改變的單一鹼基對變異稱 conserved base-pair variants。p.192
• 較大的變異包括 deletion、translocation（轉位）、insertion、inversion 或 internal duplication；有些致病變異導致子代死亡或不孕，有些較無害或可能有益而在後代建立⁠^Q101。p.192
• 變異可自發發生（原因不明），或由環境中的 mutagen（如輻射、病毒與某些化學物質）誘發。p.192
• 變異可發生在 somatic cells 與 germinal cells；人類的 somatic variants 常難以辨識；因不涉及生殖細胞，somatic variants 不會傳給後代，但部分可能參與某些腫瘤的起始（例：heritable retinoblastoma 病人獲得第二個 somatic variant 後發病）。p.192
• 刪除、插入或重複的鹼基對數目不能被 3 整除 → 下游整段 frameshift（框移），最終形成 stop codon 使訊息截短；造成 stop codon 形成的變異稱 nonsense variants。p.193
• Null variants：阻止產生活性基因產物的變異，包括 nonsense 或 missense variants：（1）直接產生 stop codon，或產生 frameshift 誘發下游提早出現 stop codon；（2）改變 acceptor splice junction site，造成 exons 喪失或 introns 被不當納入剪接後的 mRNA。p.193
• Gain of function（功能獲得）可能有益（如細菌出現抗生素抗藥性）或有害（如受體蛋白與標的蛋白結合過緊，妨礙正常生理功能）。Loss-of-function variants 典型以 autosomal recessive 模式遺傳，autosomal dominant 疾病也常屬此型。p.193

Polymorphisms（多型性）

• 許多鹼基改變對生物體幾乎無或沒有害處。Polymorphism＝在一般族群中出現頻率 >1% 的任何 DNA 序列變異⁠^Q101。p.193
• SNPs（single-nucleotide polymorphisms）對 genome-wide association studies（GWAS）的基因定位很重要。與疾病相關的關鍵多型性例：AMD 的 CFH 基因區、pseudoexfoliation syndrome（假性脫落症候群）的 LOXL1 基因。許多多型性是沉默的、只是與致病變異連鎖，但有些可能影響疾病⁠^Q101。p.193

Pathogenic variants versus polymorphisms

• Pathogenic variants＝可導致疾病的 DNA 改變；polymorphisms＝過去被認為很少致病的 DNA 變異；兩者不一定容易區分⁠^Q101。p.193
• 一般而言，pathogenic variants 改變胺基酸序列，或更劇烈地導致所編碼蛋白質變短（shortening）或不產生；polymorphisms 傾向不改變胺基酸序列（DNA 密碼的冗餘性），或改成相似的胺基酸⁠^Q101。p.193
• 不過，不改變胺基酸序列的 synonymous changes（同義變化）仍可能影響 splicing；GWAS 找到的許多疾病相關 SNPs 位於基因體的 noncoding regions⁠^Q101。p.193

⁠^Q101p.193

七、基因體、表型、單基因疾病與癌症基因（Genome, Phenotype, Single-Gene Disorders, Cancer Genes）

• Genome（基因體）：細胞或生物體內遺傳物質的總和；genotype（基因型）：就特定基因座而言的遺傳組成（如個別血型或特定酵素）；phenotype（表型）：可觀察到的物理、生理、生化或分子特徵，由基因型決定但可受環境修飾。p.193
• Phenocopy（擬表型）：完全由環境因素造成、卻酷似甚至等同某表型的臨床表現。例：congenital rubella（先天性德國麻疹）的色素性視網膜病變偶爾與 RP 混淆；cornea verticillata 常見於 X-linked 的 Fabry disease，其擬表型可由 amiodarone 等藥物誘發。p.194
• 約 4500 種疾病已知由單一基因缺陷造成，稱 monogenic（mendelian）diseases；典型遵循 3 種模式之一：autosomal dominant、autosomal recessive、X-linked；mtDNA 疾病以第四種方式——maternal inheritance——遺傳⁠^Q141。p.194

Cancer genes：oncogenes 與 tumor suppressor genes

• 癌症可由多種遺傳機制造成，包括 oncogenes（致癌基因）活化與 tumor suppressor genes 喪失。Proto-oncogene 產物常參與把外在訊息傳到調控正常生長與分化之細胞內機制的訊號傳導；proto-oncogene 序列在人類與酵母菌間高度保守；正常基因調控喪失或破壞可使其轉為 oncogenes。p.194
• Oncogenes 最早在 retroviruses 中發現（如 ras，來自 rat sarcoma virus）；也在常見非病毒性人類癌症中被活化。Oncogenes 行為類似 autosomal dominant：只需 1 個 allele 致病變異即可形成腫瘤，推測經由對訊號傳導調控的 dominant-negative effect。p.194
• Tumor suppressor genes（antioncogenes，抑癌基因）：必須有 1 份功能正常的拷貝才能防止細胞不受控增生；部分產物參與 cell cycle checkpoints，但其特點是正常功能的多樣性。p.194
• Tumor suppressor genes 例：retinoblastoma、nephroblastoma（Wilms tumor）、neurofibromatosis types 1 與 2、tuberous sclerosis（結節性硬化症）、ataxia-telangiectasia、retinocerebral angiomatosis（von Hippel–Lindau disease）的基因；除 ataxia-telangiectasia 外，這些例子表現為 autosomal dominant 性狀⁠^Q114。p.194
• 2-hit hypothesis：若 1 個 allele 因遺傳性致病變異而缺陷，另一個 allele 也必須喪失才會形成腫瘤；第二個 allele 喪失稱 loss of heterozygosity（異型合子喪失），可由第二個變異、基因缺失、染色體喪失或 mitotic recombination 造成⁠^Q114。p.194
• LHON 屬 mtDNA 的 missense／nonsense 變異所致之粒線體疾病（ND-4 第 11778 位等）⁠^Q114。BCSC 2 p.241; BCSC 2 p.243

八、表現的變異：Anticipation、Penetrance、Expressivity、Pleiotropism

Anticipation（早現）

• 變異性是人類遺傳病的內在特性：即使在同一家族中，疾病的程度、特徵或發病年齡也可不同。例：myotonic dystrophy（Steinert disease）——motor myotonia、cataracts、gonadal atrophy、presenile baldness；同一家族中其特徵性白內障影響視力的時間可從 second decade（10 多歲）到 seventh decade（60 多歲）。p.195
• Anticipation：疾病在家族連續世代中表面上更早、更嚴重發病的現象。1990 年前普遍被認為是 ascertainment（確認偏差）的假象；發現 trinucleotide tandem-repeat expansion 疾病後，知道 anticipation 反映三核苷酸重複長度逐代增加。Anticipation 發生於 autosomal dominant 疾病。p.195
• 促成 anticipation 概念復興的疾病：myotonic dystrophy、fragile X syndrome、Huntington disease、Kennedy disease（一種 spinobulbar muscular atrophy）。p.195
• 部分人類變異性可歸因於每個人遺傳背景的內在差異；同一基因在家族內或家族間表型變異的其他可辨認或推定影響因素：性別影響或限制；母體因素（子宮內環境、甚至 cytoplasmic〔如 mitochondrial〕遺傳因素）；modifying loci；genetic heterogeneity（遺傳異質性，含 isoalleles 與 genocopies）；position effects 或 somatic variants 造成的基因改變；epigenetic factors、methylation、histone formation。非遺傳因素（飲食、溫度、藥物）也可能影響基因表現⁠^Q1514。p.195

Penetrance（外顯率）

• Penetrance：描述基因效應的有或無；只要產生任何表型證據（無論多輕微）即為 penetrant，任何偵測層次都未表現則為 nonpenetrant。Penetrance 是 all-or-nothing（全有或全無）概念，統計上代表帶有該基因者中表現出任何特定性狀證據的比例。p.195
• Autosomal dominant 變異外顯率 100% 的家族中，平均 50% 子代會遺傳該基因並表現疾病證據。p.195
• 臨床判定受診斷意識與檢查方法影響：許多輕微 Marfan syndrome 若無充分散瞳下的細隙燈檢查與心臟瓣膜／大血管心臟超音波會被漏掉；「顯性遺傳」retinoblastoma 家族中，部分「nonpenetrant」父母或手足可能有自發退化的腫瘤，需 indirect ophthalmoscopy 加 scleral depression 才能發現；部分帶 Best macular dystrophy 基因者臨床檢眼鏡檢查無法辨識，必須做 electro-oculographic（EOG）檢查。因此判定「隔代」前必須仔細搜尋所有易感組織。p.196

Expressivity（表現度）

• Expressivity：特定遺傳性狀在不同患者間表現的方式與嚴重程度的多樣性。例 NF1：患童可能只有 Lisch nodules 與 cafe-au-lait spots，患病父母則可能另有大量皮膚神經纖維瘤、plexiform neurofibroma 與 optic nerve glioma。同一家族所有患者都呈現典型教科書表現極為罕見——這些差異源於 variable expressivity。p.196
• 發病年齡差異是顯性疾病展現 expressivity 的方式之一。NF1 可能的順序：出生時只有 cafe-au-lait spots → Lisch nodules 於 5–10 歲出現並逐漸增多變大 → 青春期早期皮膚 punctiform neurofibromas → 青春期後（女性）subareolar neurofibromas → 十幾歲後期 optic glioma 造成視力障礙。p.196

Pleiotropism（基因多效性）

• Pleiotropism：單一基因影響不同器官系統、呈現多種表型異常；單一基因改變可在個體的多種組織產生後果⁠^Q1514。p.196
• 例：Marfan syndrome——ectopia lentis（水晶體異位）合併 arachnodactyly（蜘蛛指）、主動脈瘤、四肢細長⁠^Q1514。p.196
• DIDMOAD（diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy, and neural deafness）syndrome：optic atrophy 合併 juvenile diabetes mellitus、diabetes insipidus 與中度感覺性聽力障礙⁠^Q1514。p.197
• Alport syndrome：neurosensory hearing loss 可伴隨遺傳性血尿性腎炎、水晶體變化（anterior lenticonus、spherophakia、cataracts）、arcus juvenilis 與白黃色視網膜病灶。p.197
• Bardet-Biedl syndrome：pigmentary retinopathy、obesity、genital hypoplasia、mental debility、polydactyly。上述疾病中，1 個特定基因的致病變異可導致多器官系統功能異常⁠^Q1514。p.197
• Leber congenital amaurosis（LCA）的 autosomal dominant 與 autosomal recessive 遺傳分別與至少 3 個與 23 個基因相關；LCA 與晚發性視網膜失養症（rod–cone 與 cone–rod）的致病基因有部分重疊⁠^Q1514。BCSC 12 p.297
• Stargardt disease 多數為 autosomal recessive、由 ABCA4 突變造成；autosomal dominant 傳遞可來自其他基因，最著名為 ELOVL4、PROM1 與 PRPH2（RDS/peripherin）⁠^{Q104 Q1514}。BCSC 12 p.302

九、尋找致病基因的方法（The Search for Genes in Specific Diseases）

PCR 與 genetic markers

• Polymerase chain reaction（PCR，聚合酶連鎖反應）：把單一或少數份 DNA／RNA 片段放大數個數量級，產生數千到數百萬份；臨床上對確立眼部感染病因極為重要，例如可在眼內液偵測多種 herpes virus 家族成員。p.197
• PCR 依賴 thermal cycling（反覆加熱與冷卻，使 DNA melting 與酵素驅動的 DNA 複製交替進行）；以與目標互補的 primers 與 DNA polymerase（通常為 Taq polymerase）選擇性重複放大；產物再作為模板，呈指數放大。p.197
• Genetic markers：細胞遺傳學研究中，偶爾可見大片段 deletion 或 translocation（例：aniridia 的 11p13）；其他標記：血型（Duffy blood group 與 Coppock cataract）、restriction fragment length polymorphisms（RFLPs，如 RP）、variable number tandem repeats 的 microsatellites，以及最近用於許多 GWAS 的 SNPs。p.197
• Cytogenetic tests 以白血球進行；其他基因標記檢測 DNA，通常取自周邊血或唾液。若某異常（或正常變異）染色體結構與疾病在家族中共同傳遞，致病變異可能位於該變異染色體上，使該基因成為該病的 cytogenetic marker。p.197–198

Gene dosage（基因劑量）

• 含特定基因的染色體片段缺失時，基因產物量由剩下的同源染色體決定：13 號染色體長臂部分 interstitial deletion 者，血清 esterase D 可能只有正常的 50%；數名此類病人同時有 retinoblastoma，因而推測 esterase 與 retinoblastoma 基因位於缺失片段內⁠^Q142。p.198
• 造成 trisomy 或特定片段三倍化的 duplication 可能產生正常 150% 的基因產物活性。p.198
• Gene dosage 似乎是 anterior segment dysgenesis（前段發育不全）的致病機制：由 FOXC1 重複或缺失造成，正常轉錄因子活性的 50% 與 150% 都會誘發此發育異常。p.198

Linkage 與疾病關聯

• 即使不知基因性質或功能，linkage studies 仍可能把基因定位到某染色體或特定標記。1937 年 Bell 與 Haldane 首次辨識人類染色體上 2 種疾病的連鎖：X 染色體上的 congenital color vision deficiency（先天色覺缺陷）與 hemophilia（血友病）。p.198
• Human Genome Project 鑑定並定位約 20,000–25,000 個基因；OMIM 列出所有已知 mendelian 疾病的資訊。人類基因定位 2 大應用：（1）藉與已知標記的連鎖找出特定遺傳病基因（緊密連鎖使產前診斷能以合理機率辨識該病，有時用於帶原者偵測，即使沒有生化檢驗）；（2）協助理解染色體疾病表型異常的成因，例：Down syndrome 典型源於 21 號 trisomy，也可由只三倍化 21 號長臂遠端的染色體重排造成。p.198
• 1 cM ≈ 100 萬 bp，且單次 meiosis 發生重組的機率 1%（recombination fraction 0.01）；meiosis 時染色體交換造成分離的頻率稱 recombination frequency。p.198–199
• 被視為連鎖時，標記之間應相距不超過 20 cM；平均每條染色體約 150 cM，整個人類基因體約 3300 cM（3 × 10^9 bp）。p.199
• LOD score（logarithm of odds score）：概似比的以 10 為底對數；概似比達 1000:1 時接受前一模型。LOD 1–2＝連鎖的潛在興趣；2–3＝提示連鎖；>3＝一般視為連鎖的證明。LOD 3 雖代表 1000:1 支持連鎖，但並不表示 type I error 低至 0.001，實際接近 0.05。p.199

Candidate gene approaches

• Candidate gene screening：篩檢在組織中大量表現、且對功能重要或只在該組織表現之基因的變異；有時候選基因是能在 transgenic animals 重現人類疾病者。例：autosomal dominant RP 與黃斑失養症的 peripherin/RDS 變異；autosomal recessive RP 的 rod cGMP phosphodiesterase β-subunit 與 cGMP-gated cation channel 變異。p.199
• Positional candidate gene screening：基因經 linkage 定位到某區域後，已知位於該區的基因成為候選。例：autosomal dominant RP 的 rhodopsin 變異（3q）、Sorsby macular dystrophy 的 TIMP3 變異（22q）、Oguchi disease 的 arrestin 基因點缺失（2q）⁠^{Q104 Q137 Q151}。p.199
• Juvenile open-angle glaucoma（JOAG，青少年型隅角開放性青光眼）定義為 40 歲前發病、隅角開放、無次發性特徵；MYOC（myocilin，舊稱 TIGR，位於 GLC1A）是第一個發現的青光眼基因，autosomal dominant MYOC 變異占最多 36% 的 JOAG 與 4% 的 POAG⁠^Q104。BCSC 10 p.16

Pathogenic variant screening、sequencing、karyotype

• 致病變異偵測方法：以放射性或螢光探針的 Sanger sequencing、single-stranded conformational polymorphism technique、denaturing gradient gel electrophoresis、RFLPs。Whole-exome sequencing 可能找到許多潛在致病變異，但確認真正致病者需要大量生物資訊。判讀基因檢測結果複雜，決定檢測與回覆結果應由（或諮詢）geneticist 或 genetic counselor 進行。p.199, p.201
• DNA 定序是最直接、最確定的方法；目前定序一段 DNA 的成本遠低於定序並鑑定其產生的peptide。定序由 mRNA 衍生的 cDNA 可快速看到 reading frames（exons）；定序含 introns 與 exons 的 genomic DNA 較費時，須知道 intron–exon 邊界並設多組 PCR。p.201
• 目前 2 大定序技術：enzymatic method（Sanger sequencing，可自動化）與 next-generation sequencing（NGS，massively parallel sequencing）；NGS 可定序個人的整個基因體；部分 NGS 方法以 allele-specific oligonucleotide probes 雜交偵測特定點變異。Fig 5-6：whole-genome shotgun sequencing 把 DNA 隨機打斷成許多小片段定序，再以電腦程式把重疊片段組成單一連續序列；contig map 顯示共同代表一段連續基因體區域的重疊 DNA 片段。p.201, p.203
• Karyotype（染色體核型）：單一體細胞染色體的系統性排列展示；檢體通常取自周邊靜脈血，特定情況可用骨髓、皮膚纖維母細胞、羊水或絨毛膜絨毛細胞；也可直接用腫瘤組織做染色體分析，如 retinoblastoma 與 Wilms tumor⁠^{Q102 Q142}。p.201
• FISH（fluorescence in situ hybridization）：以螢光標記目標基因的 DNA 片段，再與染色體雜交；chromosome arm painting 染出目標區域以判斷 duplication、deletion 或 rearrangement；螢光探針可偵測並定量染色體上特定 DNA 序列，辨識傳統細胞遺傳學方法看不出的微小異常。2-color FISH 可同時標記每條染色體的兩臂（Fig 5-7：短臂紅、長臂綠）。p.201, p.204

Table 5-1 常用基因檢測比較

UPD＝uniparental disomy；VUS＝variant of uncertain significance⁠^Q102。p.200

• Karyotype 解析度約 3.5 Mb、限制之一為 low resolution；PCR、sequencing、whole-exome sequencing 解析度達 base pair⁠^Q102。p.200
• Aneuploidy（非整倍體）指細胞內染色體數目異常⁠^{Q102 Q142}。BCSC 2 p.228
• X-linked dominant：受影響男性把性狀傳給所有女兒、不傳給任何兒子⁠^{Q102 Q142}。BCSC 2 p.223
• Autosomal recessive：受影響者的所有子女都是帶原者，除非其臨床未受影響的另一親也是帶原者，否則不太可能發病⁠^{Q102 Q142}。BCSC 2 p.218
• Retinoblastoma 就診時約 10% 有家族史、90% 無家族史；karyotype 可見的 13 號長臂部分缺失占所有 retinoblastoma 的 3%–7%⁠^Q142。BCSC 2 p.232

Genome-wide association studies（GWAS）

• 雖然 karyotyping 與 linkage analysis 仍可用於找疾病相關基因，目前多數研究使用 GWAS 與 NGS。International HapMap Project 比較 11 個族群 1184 名參考個體的 DNA 序列；以 HapMap 研究相似族群的個體時，發現許多人共享一系列 SNPs（haplotype），因此只測 1 個或少數 SNPs 可經 imputation 推斷大量鄰近 SNPs。晶片或 bead 平台可檢測全基因體 100,000 到數百萬個 SNPs。p.201–202
• GWAS 結果通常以 Manhattan plot 呈現：x 軸依序排列染色體，y 軸為關聯的 P 值（−log P）；顯著基因關聯（閾值約 5 × 10^−8）常有多個相鄰 SNPs 同時高度顯著，形成一柱點。SNP 本身很少是致病變異，通常是在 haplotype 中與致病變異連鎖，再以 fine-mapping 找因果變異。p.202–203
• AMD 的 GWAS meta-analysis（Fig 5-8）辨識出 19 個 loci；各基因效應通常小，但累積約占 AMD 遺傳度的 40%。p.205
• 比較不同族群的 GWAS 可釐清 SNP 是致病或只是連鎖：LOXL1（pseudoexfoliation）的某 SNP 在白人族群中與疾病相關，日本族群中則是 alternate SNP 與疾病相關，因此該 SNP 不太可能致病（東亞與白人族群中可能是不同 SNPs 與真正致病變異相關）；另一 SNP 在兩族群中的關聯相當。p.205

判定基因改變是否為致病變異（Table 5-2）

• Whole-exome、whole-genome sequencing 與 GWAS 找到許多 variants of unknown significance；區分 benign polymorphism 與 pathogenic variant 的證據包括：病例與對照的族群頻率資料、家系 segregation 資料、computational／predictive 資料（SIFT、PolyPhen），以及細胞與動物模型的 functional 資料。p.205

表註：支持致病性的資訊越多，臨床應用於 predictive DNA testing 或 gene therapy 等越有信心；遺傳性視網膜疾病的基因檢測現已能在高比例病例中找到致病變異。p.206

十、基因治療（Gene Therapy）

• 基因治療前景可期但仍處起步階段；主要挑戰：辨識主要疾病基因的致病變異、了解所辨識基因的致病關聯，以及發展適當的遞送系統（主要長期載體——病毒——目前受限於基因大小、發炎效應與致癌風險）。p.205

X-linked 與 recessive 疾病：補充缺失的基因產物

• Altered allele 不產生訊息或產生無效產物者稱 null allele；此類疾病可能只需把該基因補回缺陷細胞或組織即可矯正；理論上，正常基因可轉入帶 null variant 或不產生穩定轉譯產物之致病變異的人類細胞。p.205–206
• 遞送載體：adenoviruses、retroviruses（課本括號註明 especially adeno-associated viruses〔AAVs〕）與 plasmid–liposome complexes。AAV vector 基因治療已在動物模型治癒許多疾病，如 Briard dog 中造成 RP 的 RPE65 致病變異。p.206
• RPE65 人體試驗提示早期無重大不良反應、視覺功能有些改善。2017 年 FDA 核准 voretigene neparvovec-rzyl（AAV2-hRPE65v2）用於確診 biallelic RPE65-mediated retinal dystrophy（即 LCA 與 RP）病人；目前治療雙眼費用 $850,000。p.206
• RPE65 變異只占 LCA 的一小部分，因此此療法不適用所有 LCA 病人；針對幼童（<3 歲）的研究也在進行中⁠^Q1514。p.206

Dominant diseases 的策略

• 顯性疾病由基因產物不足（haploid insufficiency）或產物致病（dominant-negative effect）造成；理論上 haploid insufficiency 可用基因補充治療；由缺陷發育基因造成的顯性疾病，基因矯正必須在胎兒發育早期進行。p.207
• Dominant-negative effect 需不同方法：有些基因編碼可與另一基因 mRNA 結合、阻斷其轉譯的 RNA 分子，增進對這些基因的了解可能有助於開發可阻斷缺陷 allele mRNA 轉譯的藥物或基因編碼 RNA 分子，只讓正常 allele 表現；antisense oligonucleotides（antisense DNA）與致病 allele 的 mRNA 結合，阻止 ribosome 轉譯（Fig 5-9：經結合的立體效應，或可能誘發 RNase 降解 mRNA）。p.207
• Ribozymes：可切割特定 RNA 的 RNA 分子；siRNA：與 mRNA 結合並使其最終降解。siRNA 的挑戰：細胞內遞送，以及刺激細胞表面 TLR3 受體可誘發免疫或抗血管新生作用（generic class property）。p.207–208
• CRISPR–Cas9（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats–CRISPR-associated protein 9）基因編輯已用於矯正 DNA 點變異；理論上可與 induced pluripotent stem cell（iPSC）結合：遺傳性視網膜病病人皮膚切片 → 誘導成多能幹細胞 → 以 CRISPR–Cas9 編輯掉致病變異 → 培養成適當視網膜細胞株植入病眼。進入臨床試驗前必須克服免疫與腫瘤生成風險，且費用高。p.208